一、 介紹
旨在闡明睡眠在哺乳動(dòng)物中的作用的電生理研究已有近一個(gè)世紀(jì)的歷史，但睡眠的功能仍是一個(gè)難以捉摸的謎。睡眠狀態(tài)活動(dòng)的歧視取決于對(duì)自由活動(dòng)的動(dòng)物的腦電圖（EEG）和肌電圖（EMG）信號(hào)的準(zhǔn)確確定。腦的EEG記錄可提供有關(guān)神經(jīng)元活動(dòng)的大量信息，但局限性在于這些測(cè)量?jī)H報(bào)告了總體的神經(jīng)元放電模式。了解驅(qū)動(dòng)這些大規(guī)模神經(jīng)元事件的潛在生理機(jī)制，需要能夠準(zhǔn)確監(jiān)控神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)釋放和攝取的技術(shù)。這樣的技術(shù)可以針對(duì)大腦中的特定結(jié)構(gòu)，以補(bǔ)充電生理-臨床研究，現(xiàn)已被認(rèn)為是研究睡眠作用的重要組成部分。
準(zhǔn)確確定睡眠狀態(tài)的主要方法需要同時(shí)記錄大腦皮質(zhì)區(qū)域的EEG記錄和肌肉EMG活性的同時(shí)測(cè)量。腦電圖痕跡反映了植入顱骨的兩個(gè)獨(dú)立電極之間的微伏電位差。潛在的大小差異為50至200 lV神經(jīng)元放電引起的膜電位變化的結(jié)果活動(dòng)。腦電信號(hào)的頻率也反映了神經(jīng)元的活動(dòng)。高頻（> 12 Hz）腦電圖表明活躍，完全不同的神經(jīng)元激活通常與清醒有關(guān)。高放大器波形（> 100 lV），低頻（<5 Hz）腦電活動(dòng)，例如在慢波（SW）睡眠期間觀察到的現(xiàn)象表示皮層神經(jīng)rons以高度同步的節(jié)奏射擊。腦電圖具有5-8 Hz的頻率，其幅度小于100 lV，通常表現(xiàn)為快速眼動(dòng)（REM）睡眠。肌電圖激活通過在肌肉中放置兩個(gè)獨(dú)立的電極進(jìn)行測(cè)量，可以反映神經(jīng)元激活產(chǎn)生的電位與肌肉收縮有關(guān)。高振幅肌電圖反映活動(dòng)運(yùn)動(dòng)，而強(qiáng)音肌電圖信號(hào)表明靜止或睡眠。
盡管測(cè)量大腦和肌肉的電活動(dòng)可以指示睡眠狀態(tài)，但不能提供神經(jīng)化學(xué)功能的指示。要更好地了解滲透生理，就需要同時(shí)測(cè)量EEG記錄旁的神經(jīng)遞質(zhì)活性。L-谷氨酸，大腦中醉豐富的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，據(jù)信在睡眠過程中起著重要但尚未定義的作用。先前的大鼠研究表明，睡眠狀態(tài)之間的L-谷氨酸水平發(fā)生了變化REM睡眠過程中前額葉皮層區(qū)域的細(xì)胞外L-谷氨酸濃度增加。
量化與睡眠同時(shí)發(fā)生的時(shí)間的函數(shù)的神經(jīng)遞質(zhì)濃度并非易事。傳統(tǒng)上，這種采樣是通過微透析完成的或驗(yàn)尸技術(shù)，例如免yi組織化學(xué) 或放射自顯影。這些技術(shù)中的每一個(gè)都可以提供有用的數(shù)據(jù)，但是所有這些技術(shù)都有類似的局限性，包括無法實(shí)時(shí)監(jiān)視神經(jīng)遞質(zhì)（例如缺乏時(shí)間分辨率），以及正在監(jiān)視的空間的新生平衡（局部環(huán)境）受到干擾。例如，微透析可提供數(shù)小時(shí)或數(shù)天的采樣，但通常jin限于每個(gè)樣品不超過1-5分鐘的速率。在微透析過程中，從當(dāng)?shù)丨h(huán)境中去除分析物會(huì)擾亂自然平衡，并且樣品的采集后處理非常費(fèi)力。驗(yàn)尸技術(shù)的局限性在于每只動(dòng)物只能產(chǎn)生一個(gè)可用的時(shí)間點(diǎn)，而犧牲的必要步驟會(huì)干擾睡眠的測(cè)量[8b]。也嘗試過將非侵入性技術(shù)（例如MRI）與EEG記錄同時(shí)使用，但是這些技術(shù)要求動(dòng)物在整個(gè)采樣期間保持固定狀態(tài)。
同時(shí)測(cè)量腦電圖，肌電圖和L-谷氨酸生物傳感器的記錄非常適合量化睡眠過程中神經(jīng)遞質(zhì)釋放的每秒變化，而不會(huì)干擾局部環(huán)境的平衡。生物傳感器采用生物識(shí)別元件（通常是酶）來產(chǎn)生電活性物質(zhì)，然后在轉(zhuǎn)導(dǎo)元件上將其氧化。在L-谷氨酸生物傳感器的情況下，極化至0.6 V的Pt-Ir電極涂在含有生物元素L-谷氨酸氧化酶的基質(zhì)中。生物傳感器周圍細(xì)胞外空間中的谷氨酸鹽被L-谷氨酸氧化酶轉(zhuǎn)化為過氧化氫（H2O2）。酶產(chǎn)生的H2O2然后通過各種膜層擴(kuò)散到Pt–Ir表面，在此被氧化，產(chǎn)生可測(cè)量的安培電流。
睡眠剝奪儀 型號(hào)：XR-XS108
醉近的研究強(qiáng)調(diào)了在大鼠模型中結(jié)合EEG和EMG記錄以及同時(shí)進(jìn)行生物傳感器測(cè)量的有效性。這些研究報(bào)告了蘇醒期間谷氨酸能活動(dòng)的升高和REM睡眠發(fā)作期間谷氨酸水平的顯著升高。無一例外，所有這些研究都是使用大鼠作為模型生物進(jìn)行的。由于大鼠的體型大，它對(duì)生理學(xué)研究是有利的，但是這些研究的結(jié)果很難用于基礎(chǔ)遺傳學(xué)。憑借其作為遺傳模型的用途，小鼠是研究睡眠的強(qiáng)大得多的手段。
二、實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備
小鼠在手術(shù)前至少12小時(shí)光照12小時(shí)黑暗周期（LD 12:12）下飼養(yǎng)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，所有小鼠均保持在LD 12:12，食物和水可自由飲用。
三、手術(shù)方法
使用***（100 mg/kg））甲苯噻嗪（10 mg/kg）對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，并通過外科手術(shù)植入電極進(jìn)行EEG和EMG記錄。將一根帶有金屬絲的不銹鋼螺釘放置在額骨區(qū)域（A/P -1.0 mm，M/L-1.5毫米）和兩根帶電線的螺釘置于后腦上方（A/P：3.0毫米，M/L±1.5毫米）。使用雙Pt-Ir電極監(jiān)測(cè)EMG活性，該電極部分涂有特氟隆，兩側(cè)插入頸背區(qū)域（頸部）肌肉。所有電極引線均連接至預(yù)制的頭戴式支架，并用牙科丙烯酸酯密封樹脂。
四、EEG/GEMG數(shù)據(jù)收集
提供了一個(gè)預(yù)放大器單元，牢固地連接到鼠標(biāo)頭枕上第yi級(jí)放大（100*）和初始高通濾波（對(duì)于EEG，一階0.5 Hz，對(duì)于EMG是10 Hz）。然后將信號(hào)通過系鏈和低扭矩?fù)Q向器連接到上海欣軟信息科技有限公司的腦電肌電采集系統(tǒng)。放大器調(diào)節(jié)單元提供了額外的50信號(hào)放大，額外的高通濾波和8階橢圓低通濾波器（50 Hz EEG和200 Hz EMG）。然后，以500 Hz采樣信號(hào)，使用14位AAD轉(zhuǎn)換器將其數(shù)字化，然后通過USB路由至基于PC的采集和分析軟件包。從本質(zhì)上講，小鼠是夜行性動(dòng)物，其晝夜節(jié)律使得在“熄燈”期間可以觀察到大多數(shù)喚醒活動(dòng)。通常在“開燈”期間觀察到睡眠，尤其是REM睡眠。在“熄燈”期開始后連續(xù)收集了EEG，EMG信號(hào)。實(shí)驗(yàn)的前12小時(shí)（“熄燈”）專門用于傳感器磨合和建立穩(wěn)定的生物傳感器信號(hào)。在接下來的12小時(shí)內(nèi)（“點(diǎn)亮”），對(duì)應(yīng)于SW和REM睡眠量醉多的時(shí)期，收集了EEG，EMG數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
